RESUMO
Abstract Livestock is a fundamental part of the agriculture industry in Pakistan and contributes more than 11.53% to GDP. Among livestock species, the buffaloes are regarded as the black gold of Pakistan. Being the highest milk producers globally, Nili-Ravi buffaloes are the most famous ones. Buffaloes are affected by many endemic diseases, and "Hemorrhagic septicemia" (HS) is one of them. This study was designed to ascertain the effects of experimental exposure ofP. multocida B:2 (oral) and its immunogens, i.e., LPS (oral and intravenous) and OMP (oral and subcutaneous) on reproductive hormonal profiles in Nili-Ravi buffaloes. Repeated serum samples were collected from the jugular vein of experimental animals for 21 days (0, 02, 04, 08, 12, 16, 20, 24, 36, 48, 72, 120, 168, 216, 264, 360, 456 and 504 hours). Hormonal assays to determine the serum concentrations of Gonadotropin-releasing hormone (GnRH), Follicle-stimulating hormone (FSH), Luteinizing hormone (LH), Estrogen (E2) and progesterone (P4) were performed using (MyBioSource) commercial Elisa kits. The hormonal profile of all treatment groups of the buffalo heifers exhibited significant (P<0.05) variations as compared to the control group (G-1). These results indicate suppression in Nili-Ravi buffaloes' reproductive hormonal profile on exposure to P. multocida B:2 and its immunogens. This influence warrants that exposure to H.S may be a possible reason for delayed puberty and poor reproduction performance in Nili-Ravi buffaloes.
Resumo A pecuária é uma parte fundamental da indústria agrícola no Paquistão e contribui com 11,53% do PIB nacional. Entre as espécies de gado, os búfalos são considerados o ouro negro do Paquistão. Sendo os maiores produtores de leite em todo o mundo, os búfalos Nili-Ravi são os mais famosos. Os búfalos são afetados por muitas doenças endêmicas, entre as quais a "septicemia hemorrágica" (SH). Este estudo busca verificar os efeitos da exposição experimental de P. multocida B:2 (oral) e seus imunógenos, ou seja, LPS (oral e intravenoso) e OMP (oral e subcutâneo), nos perfis hormonais reprodutivos em búfalos Nili-Ravi. Amostras de soro repetidas foram coletadas da veia jugular de animais experimentais por 21 dias (0, 2, 4, 8, 12, 16, 20, 24, 36, 48, 72, 120, 168, 216, 264, 360, 456 e 504 horas). Os ensaios hormonais para determinar as concentrações séricas do hormônio liberador de gonadotrofina (GnRH), hormônio foliculoestimulante (FSH), hormônio luteinizante (LH), estrogênio (E2) e progesterona (P4) foram realizados usando kits comerciais Elisa (MyBioSource). O perfil hormonal de todos os grupos de tratamento das novilhas bubalinas apresentou variações significativas (P < 0,05) em relação ao grupo controle (G-1). Esses resultados indicam supressão no perfil hormonal reprodutivo de búfalos Nili-Ravi na exposição a P. multocida B:2 e seus imunógenos. Essa influência garante que a exposição à SH possa ser uma possível razão para o atraso da puberdade e o baixo desempenho reprodutivo em búfalos Nili-Ravi.
Assuntos
Animais , Feminino , Infecções por Pasteurella/veterinária , Reprodução , Hormônios Esteroides Gonadais/sangue , Búfalos , Progesterona , Bovinos , Lipopolissacarídeos , Hormônio Liberador de Gonadotropina , Pasteurella multocidaRESUMO
Abstract Livestock is a fundamental part of the agriculture industry in Pakistan and contributes more than 11.53% to GDP. Among livestock species, the buffaloes are regarded as the black gold of Pakistan. Being the highest milk producers globally, Nili-Ravi buffaloes are the most famous ones. Buffaloes are affected by many endemic diseases, and "Hemorrhagic septicemia" (HS) is one of them. This study was designed to ascertain the effects of experimental exposure ofP. multocida B:2 (oral) and its immunogens, i.e., LPS (oral and intravenous) and OMP (oral and subcutaneous) on reproductive hormonal profiles in Nili-Ravi buffaloes. Repeated serum samples were collected from the jugular vein of experimental animals for 21 days (0, 02, 04, 08, 12, 16, 20, 24, 36, 48, 72, 120, 168, 216, 264, 360, 456 and 504 hours). Hormonal assays to determine the serum concentrations of Gonadotropin-releasing hormone (GnRH), Follicle-stimulating hormone (FSH), Luteinizing hormone (LH), Estrogen (E2) and progesterone (P4) were performed using (MyBioSource) commercial Elisa kits. The hormonal profile of all treatment groups of the buffalo heifers exhibited significant (P 0.05) variations as compared to the control group (G-1). These results indicate suppression in Nili-Ravi buffaloes' reproductive hormonal profile on exposure to P. multocida B:2 and its immunogens. This influence warrants that exposure to H.S may be a possible reason for delayed puberty and poor reproduction performance in Nili-Ravi buffaloes.
Resumo A pecuária é uma parte fundamental da indústria agrícola no Paquistão e contribui com 11,53% do PIB nacional. Entre as espécies de gado, os búfalos são considerados o ouro negro do Paquistão. Sendo os maiores produtores de leite em todo o mundo, os búfalos Nili-Ravi são os mais famosos. Os búfalos são afetados por muitas doenças endêmicas, entre as quais a septicemia hemorrágica (SH). Este estudo busca verificar os efeitos da exposição experimental de P. multocida B:2 (oral) e seus imunógenos, ou seja, LPS (oral e intravenoso) e OMP (oral e subcutâneo), nos perfis hormonais reprodutivos em búfalos Nili-Ravi. Amostras de soro repetidas foram coletadas da veia jugular de animais experimentais por 21 dias (0, 2, 4, 8, 12, 16, 20, 24, 36, 48, 72, 120, 168, 216, 264, 360, 456 e 504 horas). Os ensaios hormonais para determinar as concentrações séricas do hormônio liberador de gonadotrofina (GnRH), hormônio foliculoestimulante (FSH), hormônio luteinizante (LH), estrogênio (E2) e progesterona (P4) foram realizados usando kits comerciais Elisa (MyBioSource). O perfil hormonal de todos os grupos de tratamento das novilhas bubalinas apresentou variações significativas (P 0,05) em relação ao grupo controle (G-1). Esses resultados indicam supressão no perfil hormonal reprodutivo de búfalos Nili-Ravi na exposição a P. multocida B:2 e seus imunógenos. Essa influência garante que a exposição à SH possa ser uma possível razão para o atraso da puberdade e o baixo desempenho reprodutivo em búfalos Nili-Ravi.
RESUMO
Las epidemias de cólera afectan a un gran número de países africanos, asiáticos y del Caribe. Los cambios climatológicos y las constantes migraciones hacen que esta enfermedad se extienda, por lo que resulta necesario disponer de vacunas protectoras. En el presente trabajo se caracterizó una nueva vacuna de vesículas de membrana externa (VMEs) obtenidas de Vibrio cholerae O1 biotipo El Tor serotipo Ogawa cepa C7258, en el Instituto Finlay de vacunas (Cuba), a través de métodos proteómicos. Se identificaron 53 proteínas presentes en las VME (4 proteínas por banda electroforética) separadas por electroforesis unidimensional (1D) y digeridas con tripsina. Los fragmentos obtenidos fueron separados por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) acoplada a espectrometría de masa, secuenciados e identificados mediante bases de datos de proteínas Swiss-Prot y TrEMBL. El patrón proteico obtenido presentó algunas de las proteínas (12 proteínas citoplasmáticas y 5 proteínas de membrana externa) sugeridas dentro del proteoma de buena calidad para candidatos vacunales. Se estudiaron las mejores condiciones para la separación de las proteínas a través de electroforesis bidimensional. Las VME evaluadas cuentan con una composición fundamentada en proteínas necesarias para garantizar una respuesta inmune que proteja contra Vibrio cholerae O1 biotipo El Tor serotipo Ogawa.
Cholera epidemics affect a large number of African, Asian and Caribbean countries. The climate changes and the constant migrations cause this disease to spread, making it is necessary to obtain protective vaccines. In the present work, a new vaccine of outer membrane vesicles (OMV) from V. cholerae O1 El Tor biotype Ogawa serotype strain C7258 at Finlay Institute of vaccines (Cuba) was characterized by proteomic methods. A total of 53 proteins present in the OMV (approximate ratio of 4 proteins by electrophoresis band) were identified, separated by one dimension electrophoresis and digested by tripsin method. The fragments were separated by high performance liquid chromatography (HPLC) coupled to mass spectrometry, sequenced and identified, using Swiss-Prot and TrEMBL protein databases. The pattern showed some proteins (12 cytoplasmic proteins and 5 outer membrane proteins) suggested within the highest quality proteome for vaccine candidate. The best conditions for proteins separation by two dimension electrophoresis were studied. The OMV composition was based on proteins described to the immunity response and protection against V. cholerae O1 El Tor biotype Ogawa serotype.
As epidemias de cólera afetam um grande número de países africanos, asiáticos e caribenhos. As mudanças climáticas e as constantes migrações fazem com que esta doença se espalhe, portanto é necessário ter vacinas protectoras. No presente trabalho, uma nova vacina de vesículas de membrana externa (VMEs) obtidas de Vibrio cholerae 01 biotipo El Tor sorotipo Ogawa cepa C7258, no Instituto de Vacinas Finlay (Cuba), através de métodos proteômicos. Foram identificadas 53 proteínas presentes nas VME (4 proteínas por banda eletroforética) separadas por eletroforese unidimensional (1D) e digeridas com tripsina. Os fragmentos obtidos foram separados por cromatografia de alta resolução (HPLC) acoplada a espectrometria de massa, sequenciados e identificados usando bancos de dados de proteínas Swiss-Prot e TrEMBL. O padrão proteico obtido apresentou algumas das proteínas (12 proteínas citoplasmáticas e 5 proteínas de membrana externa) sugeridas dentro do proteoma de boa qualidade para candidatos vacinais. As melhores condições para a separação de proteínas através de eletroforese bidimensional foram estudadas. As VME avaliados possuem uma composição baseada em proteínas necessárias para garantir uma resposta imune que proteja contra Vibrio cholerae O1 biotipo El Tor sorotipo Ogawa.
Assuntos
Proteínas da Membrana Bacteriana Externa , Vacinas , Cólera/tratamento farmacológico , Proteômica , Espectrometria de Massas , Mudança Climática , Cólera , Cromatografia , Cromatografia Líquida de Alta Pressão , Vibrio cholerae O1 , Eletroforese , MicrobiologiaRESUMO
Las vacunas compuestas por vesículas de membrana externa (VMEs) previenen de manera exitosa la enfermedad meningocócica del serogrupo B. Esta plataforma tecnológica de obtención puede ser aplicada para otros patógenos bacterianos Gram negativos. Una vacuna de VMEs desarrollada contra Shigella sonnei fue obtenida a través de una extracción de componentes celulares y su caracterización por electroforesis en geles de poliacrilamida unidimensional (1D). Se estudiaron las mejores condiciones de solubilización de las muestras, separación electroforética e identificación a través de espectrometría de masas acoplada a cromatografía de alta presión después del corte de las bandas y su tratamiento enzimático con tripsina. En esta etapa se identificaron un total de 57 proteínas en 23 bandas (2,5 proteínas por banda escindida), 47 de las proteínas no repetidas. Las proteínas inmunogénicas presentes en VMEs de S. sonnei fueron cuantificadas en cuanto a masa molecular por 1D-Western blotting en membranas de nitrocelulosa con anticuerpos obtenidos a partir de ratones inmunizados con las VMEs. Como que las bandas electroforéticas 1D contenían más de una proteína, se estudiaron las mejores condiciones de separación por el método de electroforesis bidimensional (2D) para el establecimiento del mapa proteico; tal que el incremento del tamaño de las tiras, el tiempo de focalización y la aplicación catódica garantizaron la mayor resolución(AU)
Outer membrane vesicles (OMVs) vaccines successfully prevent Group B meningococcal disease. This platform technology may be applied against other Gram negative bacterial pathogens. An OMV vaccine against Shigella sonnei was prepared by detergent extraction of cells and characterised by one-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis (1D). The protein components were quantified by staining and scanning and the composition of bands were defined by coupled high-performance low chromatography/electrospray ionization tandem mass spectrometry after band excision and in-gel trypsin digestion. 57 proteins contained in 23 bands (2.5 proteins/split band) were detected, 47 of them were not repeated. The S. sonnei OMVs immunogenic proteins were identified by 1D-immunoblotting, after transfer of proteins to a nitrocellulose membrane and treatment with antibodies generated by immunisation of mice with the OMVs. The bands detected by 1D had more than a single proteins, that is why we studied the best conditions for molecular separation by two-dimension electrophoresis (2D) for establishing the protein map; such that the increase of strips size, time of isoelectric focusing (IEF) and cup-cathodic loading guaranteed the highest resolution(AU)
Assuntos
Vacinas/imunologiaRESUMO
Las vacunas compuestas por vesículas de membrana externa (VMEs) previenen de manera exitosa la enfermedad meningocócica del serogrupo B. Esta plataforma tecnológica de obtención puede ser aplicada para otros patógenos bacterianos Gram negativos. Una vacuna de VMEs desarrollada contra Shigella sonnei fue obtenida a través de una extracción de componentes celulares y su caracterización por electroforesis en geles de poliacrilamida unidimensional (1D). Se estudiaron las mejores condiciones de solubilización de las muestras, separación electroforética e identificación a través de espectrometría de masas acoplada a cromatografía de alta presión después del corte de las bandas y su tratamiento enzimático con tripsina. En esta etapa se identificaron un total de 57 proteínas en 23 bandas (2,5 proteínas por banda escindida), 47 de las proteínas no repetidas. Las proteínas inmunogénicas presentes en VMEs de S. sonnei fueron cuantificadas en cuanto a masa molecular por 1D-Western blotting en membranas de nitrocelulosa con anticuerpos obtenidos a partir de ratones inmunizados con las VMEs. Como que las bandas electroforéticas 1D contenían más de una proteína, se estudiaron las mejores condiciones de separación por el método de electroforesis bidimensional (2D) para el establecimiento del mapa proteico; tal que el incremento del tamaño de las tiras, el tiempo de focalización y la aplicación catódica garantizaron la mayor resolución(AU)
Outer membrane vesicles (OMVs) vaccines successfully prevent Group B meningococcal disease. This platform technology may be applied against other Gram negative bacterial pathogens. An OMV vaccine against Shigella sonnei was prepared by detergent extraction of cells and characterised by one-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis (1D). The protein components were quantified by staining and scanning and the composition of bands were defined by coupled high-performance low chromatography/electrospray ionization tandem mass spectrometry after band excision and in-gel trypsin digestion. 57 proteins contained in 23 bands (2.5 proteins/split band) were detected, 47 of them were not repeated. The S. sonnei OMVs immunogenic proteins were identified by 1D-immunoblotting, after transfer of proteins to a nitrocellulose membrane and treatment with antibodies generated by immunisation of mice with the OMVs. The bands detected by 1D had more than a single proteins, that is why we studied the best conditions for molecular separation by two-dimension electrophoresis (2D) for establishing the protein map; such that the increase of strips size, time of isoelectric focusing (IEF) and cup-cathodic loading guaranteed the highest resolution(AU)
Assuntos
Shigella sonnei , Vacinas/uso terapêuticoRESUMO
A leptospirose é uma zoonose que causa sérios danos à saúde dos animais. Por se tratar de uma das doenças de maior impacto econômico, o correto diagnóstico e vigilância epidemiológica são fundamentais para o controle da infecção. Objetivou-se padronizar e validar o teste de ELISA indireto empregando proteínas de membrana externa (PME) do sorovar Hardjo como antígeno (ELISA-PME/Hardjo), tendo o teste de Soroaglutinação Microscópica (SAM) como referência. O ELISA-PME/Hardjo foi padronizado utilizando-se amostras de soro de 15 bovinos positivos e 15 negativos no exame de SAM. A PME/Hardjo foi avaliada nas concentrações de 0,35 µg/µL, 0,17 µg/µL, 0,08 µg/µL e 0,04 µg/µL. As amostras de soro foram testadas nas diluições 1:50, 1:100, 1:500 e 1:1000, e o conjugado anti IgG 1:5000 e 1:10000. A validação do teste foi feita utilizando-se 218 amostras de soro bovino. A padronização do ELISA-PME/Hardjo indicou que a melhor concentração protéica para sensibilização da placa foi de 0,08 µg/µL, diluição do anticorpo primário 1:50 e do conjugado anti-IgG 1:5000. Das 218 amostras submetidas ao teste de SAM, 86 (39%) foram positivas, e 132 (61%) negativas. Já o ELISA-PME/Hardjo identificou 121 (55%) amostras positivas e 97 (45%) negativas. A sensibilidade foi de 100% e especificidade 73%. A comparação dos testes de SAM e ELISA demonstrou concordância de 0,83% e índice Kappa de 0,68 (p<0,0001). O ELISA-PME/Hardjo mostrou ser um teste sensível, indicando seu uso potencial como exame de triagem no diagnóstico da leptospirose bovina.
Leptospirosis is a zoonotic disease that causes serious health risks to animals. It is a disease of high economic impact, therefore the correct diagnosis and surveillance are essential to control infection. The aim of this study was to standardize and validate an indirect ELISA using outer membrane proteins (OMPs) of serovar Hardjo as the antigen of the test (ELISA-OMP/Hardjo), using the microscopic agglutination test (MAT) as a reference. The ELISAOMP/Hardjo was standardized using 15 serum samples from positive animals and 15 negative in the MAT. The OMP / Hardjo was evaluated at concentrations of 0.35 µg / µL, 0.17 µg / µL, 0.08 µg / µL and 0.04 µg / µL. Serum samples were tested at dilutions 1:50, 1:100, 1:500, 1:1000, and anti IgG conjugate in 1:5000 and 1:10000. The validation of the test was performed using 218 serum samples. The standardization of ELISA-OMP/Hardjo indicated that the best protein concentration for sensitization of the plate was 0.08 µg / µL, 1:50 dilution of primary antibody and conjugated anti-IgG 1:5000. Of the 218 samples tested in MAT, 86 (39%) were positive and 132 (61%) negative. ELISA-OMP/Hardjo already identified 121 (55%) positive samples and 97 (45%) negative. The sensitivity was 100% and specificity 73%. Comparison of MAT and ELISA tests showed concordance of 0.83% and Kappa of 0.68 (p <0.0001). The ELISA-OMP/Hardjo proved to be a sensitive test, indicating its potential as a screening tool in the diagnosis of bovine leptospirosis.
